如何测定蛋白质中的氮元素含量?

如何测定蛋白质中的氮元素含量?
如何测定蛋白质中的氮元素含量?

如何测定蛋白质中的氮元素含量?
这是最经典的方法了——微量凯氏法
一、原理
植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮.非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺,以及少量无机氮化物,是可溶于三氯乙酸溶液的小分子.可加入三氯乙酸,使其最终浓度为5％,将蛋白质沉淀出来,分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮；通常只测定总氮或蛋白氮.将植物材料与浓硫酸共热,硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧,并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨,并进一步生成硫酸铵.为了加速有机物质的分解,在消化时通常加入多种催化剂,如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等.消化完成后,加入过量NaOH,将NH4+转变成NH3,通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中,再用标准盐酸滴定,直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度.滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数,通过计算,可得出含氮量.
蛋白质是一类复杂的含氮化合物,每种蛋白质都有其恒定的含氮量,（约在14％～18％,平均约含氮16％）所以,可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25）,算出蛋白质的含量.若以总氮含量乘以6.25,就是样品的粗蛋白含量.试样中若含有硝态氮时,首先要使硝态氮还原为铵态氮,可加入水杨酸和硫代硫酸钠,使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸,再用硫代硫酸钠粉使硝基水杨酸转化为铵盐.由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸,所以消化时的硫酸用量要酌情增加.
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：各种干燥、过筛（60～80目）的植物样品
（二）仪器设备：1.消化管；2.微量凯氏定氮蒸馏装置一套（图17）；3.三角烧瓶；4.微量滴定管；5.量筒；6.容量瓶；7.烧杯；8.移液管等.
三、实验步骤
（一）样品提取分离：准确称取烘至恒重的样品0.1000g～0.5000g（依样品含氮量而定,含氮1～3mg宜）,置10ml离心管中,加入5ml5％三氯乙酸,90℃水浴中浸提15min,不时搅拌,取出后用少量蒸馏水冲洗玻棒,待溶液冷却后,4000rpm离心15min,上清液弃去.并用5％三氯乙酸洗沉淀2～3次,离心,弃去上清液,最后用蒸馏水将沉淀无损地洗入铺有滤纸的漏斗上,去掉滤液后,将沉淀和滤纸在50℃下烘干,用于蛋白氮的测定.
（二）样品的消化：取4支消化管编号.1号管直接放入称好的材料用于测定总氮,2号管放入上述烘干的滤纸和沉淀,用于蛋白氮的测定,3号管放入同样滤纸一张、4号管不加任何样品作为空白对照,注意将样品放入消化管底部.向各消化管加浓硫酸5ml,混合催化剂0.3g～0.5g,将样品浸泡数h或放置过夜后,在管口盖一小漏斗,放在远红外消煮炉上加热消化.开始时温度可稍低,以防止内容物上升至管口.泡沫多时,可从小漏斗加入2～3滴无水乙醇.到管口出现白色雾状物时,泡沫已不再产生；此时可逐渐升温,使内容物达到微沸.直到消化液变为清澈透明为止.消化过程中,若在消化管上部发现有黑色颗粒时,应小心地转动消化管,用消化液将它冲洗下来,以保证样品消化完全.消化过程约需2～3h.
（三）定容消化完毕待溶液冷却后,沿管壁仔细加入10ml左右无氨蒸馏水,以冲洗管壁,再将消化液小心转入100ml容量瓶中.以无氨水少量多次冲洗消化管,洗涤液并入容量瓶.冷却后用无氨水定容至刻度,混匀备用.
（四）蒸馏及滴定 以下几步进行：
1.仪器的洗涤：先经一般洗涤后,还要用水蒸气洗涤.可按下列方法进行蒸气洗涤.先在蒸气发生器中加入2／3体积的蒸馏水（事先加入几滴浓硫酸,使其酸化,加入甲基红指示剂,并加入少许沸石或毛细玻璃管以防止爆沸）.打开漏斗下的夹子,用电炉或酒精炉加热至沸腾,使水蒸气通入仪器的各个部分,以达到清洗的目的.在冷凝管下端放置一个三角瓶接收冷凝水.然后关紧漏斗下的夹子,继续用蒸气洗涤5min.冲洗完毕,夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管,蒸馏瓶中的废液由于减压而倒吸进入收集器,打开收集器下端的活塞排除废液.如此清洗2～3次,再在冷凝管下端换放一个盛有硼酸－指示剂混合液的三角瓶,使冷凝管下口完全浸没在液面以下0.5cm处,蒸馏1～2min,观察三瓶内的溶液是否变色.如不变色,表示蒸馏装置内部已洗干净.移去三角瓶,再蒸馏1～2min,用蒸馏水冲洗冷凝管下口,关闭电炉,仪器即可供测定样品使用.
2.标准硫酸铵测定为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术,并检验实验的准确性,找出系统误差,常用已知浓度的标准硫酸铵测试三次.在三角瓶中加入20ml硼酸－指示剂混合液,将此三角瓶承接在冷凝管下端,并使冷凝管的出口浸入溶液中.注意在加样前务必打开收集器活塞,以免三角瓶内液体倒吸.准确吸取2ml硫酸铵标准溶液,加到漏斗中.
四、结果计算
样品中总氮量（％）＝0.010×（V3—V0）×100×14/（W×1000×10）×100×氮的回收率
样品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×（V1－V2－V0）×100×14/（W×5×1000）×100×氮的回收率
回收率（％）＝0.0100×（V－V0）×14/（2.0×0.6×100）×100