谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?

谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?
谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?

谁做过酶切质粒的实验啊,制感受态细胞然后转化呢?
大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液（如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升）,然后加水稀释至离心管的2/3体积. 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心,弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存
转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素
1、 感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主（受体）细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化.
在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系.
所谓的感受态,即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用.细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键.
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）.
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,
使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法,CaCl2等化学试剂法）处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法）,该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子.
Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍.
化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化.
除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA.因操作简便,愈来愈为人们所接受.
3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已
经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株,OD600为0．5时,细胞密度在5×107个/ml左右.（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）.密度过高或不足均会使转化率下降.
此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降.一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和.
对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化.此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子.
整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.
⑸、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低.
大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化
实验目的
1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义.
2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法.
3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法.
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术.
转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,常用 RM 符号表示.
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法
感受态细胞：处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态.
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant ).
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞,用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态,然后与 pUC18质粒共保温,实现转化. pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性,用 Apr符号表示.将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释,在含氨苄青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡.
影响转化率的因素
细胞生长状态和密度.
转化的质粒 DNA 的质量和浓度.
试剂的质量.防止杂菌和其它外源 DNA 的污染.
实验仪器 离心设备
实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基,0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素pUC18质粒
实验步骤
菌株活化:
1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α,在LB培养基平板表面划线,于37℃培养16小时
2.挑取一个单菌落,转到3－5mlLB培养基中,于37℃培养3－5小时
3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时,到OD600＝0.3－0.4感受态细胞制备:
4.将培养液转入1.5ml离心管中,在冰上放置15－30min
5.4000rpm离心5min,弃上清
6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀,冰上预冷10min
7.4000rpm离心5 min,弃上清
8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀,即可使用.也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
外源DNA的转化:
9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中,于冰上放置30min
10.于42℃水浴90S
11.冰上放置2min
12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时
13.将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上
14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时,然后观察结果
对照组
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现.
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.
转化率统计每个培养皿中的菌落数.
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

细胞株前的BEL什么意思